Linked immunosorbent assay (ELISA, ELISA). Podstatou zásady způsobu a fází výzkumu. Analýza protilátkových tříd protilátek, imunitním komplexem.

V souvislosti s rozvojem mobilních technologií, molekulární biologie, genetiky, fyziky, chemie a mnoho dalších high-tech oborů v každodenní praxi zavádění nových vysoce přesné a high-tech metod. Tyto trendy ovlivňují a interdisciplinární oblast medicínských znalostí, a příbuzných oborů biologických, biochemických problémů. široce rozšířen a zavedení rozšířeného způsobu klinické laboratorní diagnostiky, volal enzymoimuno za posledních deset let.

Obecně platí, že technologie imunologických a enzymatických reakcí radiologické široce používány v buněčné psaní, buněčných kultur různých tkáních od počátku 80. let XX století. Nicméně, tyto metody jsou velmi časově náročné, nejednotné, nejsou standardizovány, což vylučuje jejich použití v terapeutické a diagnostické účely v houfech. Tyto metody používají úzký, high-tech a vysoce specializované laboratoře.

Nicméně, s rozvojem technologií, mikrotechnologií, výrobu různých biopolymemích látek umožnily vyrobit hotové sady ELISA diagnostiku, které budou moci využívat laboratoře zdravotnických zařízení Běžným. ELISA je široce používán pro diagnostiku různých infekcí (chlamydie, syfilis, cytomegaloviru, toxoplazmózy, herpes atd), akutní i chronické, a latentní formy, které se vyskytují bez klinických simptomov.Takzhe Tato metoda se používá pro kontrolu chronických choroby. Zkusme pochopit, co tato metoda je a na jakých principech je založen?

Komponenty linked immunosorbent assay - imunitní odpověď a enzymatické reakce

Enzymová imunoanalýza, jak jméno napovídá, se skládá ze dvou různých složek - imunitních reakcí a enzymatických reakcí. Imunitní reakce vytváří vazebné biologické molekuly, buňky nebo buněk mikroorganismů, které jsou ve skutečnosti snaží najít a enzymatická reakce nám umožňuje vidět a měřit výsledek imunologické reakce. To znamená, že imunitní odpověď - je součástí komplexního techniky, která ve skutečnosti detekuje požadovaný mikroba. Enzymatické reakce - je to, že součástí komplexního techniky, která umožňuje překládat výsledek imunitní odpovědi ve formě oka viditelné a přístupné měření běžných chemických technik. na takovém způsobu konstrukce imunotestu, jsme analyzovat obě strany samostatně.

Imunitní odpověď, která je? Co je protilátka, antigen?

Co je to imunitní odpověď? Co je to antigen?
Nejprve analyzovat, co imunitní odpovědi. imunitní odpovědi - specifická vazebná reakce antigenu s protilátkou za vzniku imunitního komplexu. Co to znamená? Na povrchu každé buňce jakéhokoliv organismu existují zvláštní struktury zvané antigeny. Antigeny obecně - jsou molekuly, které nesou informace o buňce (jako informace o odznaku u člověka, který stanoví základní údaje o osobě).

Individuální a specifické antigeny - co to je? Proč potřebujeme tyto antigeny?

existují jednotlivé antigeny, které je jedinečné pro tohoto konkrétního organismu. Tyto jednotlivé antigeny se liší od všech lidí, tam je podobná k sobě, ale přesto se liší. Dvě identické kopie jednotlivých antigenů neexistují!

Druhou hlavní typ antigenu - je antigeny druh, která je vlastní v každém z jednotlivých druhů živých tvorů. Například, osoba je přítomen specifický antigen, který je společný pro všechny lidi, u myší, že je myší antigen druh, atd Na povrchu každého článku jsou nutně představovat druhy a individuální antigen.

Použitý specifický antigen buněk imunitního systému pro uznání. „- někoho jiného“

Jak je rozpoznání antigen?

Imunitní buňky spojené s podezřelou buňky a nese označení je na individuální antigenu. Imunitní paměť „zapsat“ buňka vypadá „jejímu antigenu.“ Tedy, v případě, shodovat s antigen podezřelé buňky popis „její antigen“, znamená to, že buňky vlastního těla a ne vážně. Potom se buňky imunitního systému „nevázaná“ a odchází. A v případě, že antigen není stejný jako popis „a“, zatímco buňky imunitního systému identifikuje buňku jako ‚cizí‘ a tudíž potenciálně nebezpečné pro celý organismus. V tomto případě se buňky imunitního systému není „nevázaná“ a začne ničit nebezpečný objekt. Přesnost takového imunologické rozpoznávání je ohromující - 99,97%. prakticky žádné chyby!

Co je protilátka imunní komplex?
Jaký je protilátka?

Protilátka - speciální molekula se nachází na povrchu imunitních buněk. Že protilátka se váže na antigen a podezřelých buněk. Další protilátka přenáší informace do buňky, kde se uznání, a obdrží zpětný signál ze dvou typů „A“ nebo „soupeře.“ Je-li signál „a“ protilátky rozrušuje komunikace s antigenem a uvolňuje buněk.

Co je imunní komplex?
Když je „cizí“ Situace signál odvíjí jinak. Protilátka nemusí přerušit spojení s antigenem, a naopak, odesláním specifické signály, způsobuje „vyztužení“. Biologicky to znamená, že další protilátky v druhé části buněk začne pohybovat do oblasti, kde hrozí nebezpečí signál, a také tvořit vazbu mezi antigenem a zachytil. Nakonec, je antigen je obklopen na všech stranách a pevně privyazan.Takoy antigen + protilátky zvané imunitní komplex. Od té chvíle, likvidaci antigenu. Ale teď podrobnosti o procesu neutralizace antigenu nemáme zájem.

Typů protilátek (IgA, IgM, IgG, IgD, IgE)
Protilátka - struktura proteinu, které mají vždy chemický název, který se používá jako synonymum pro expresi protilátky. To znamená, protilátky jsou imunoglobuliny =.

Existuje pět typů imunoglobulinů (Ig), které se váží na různé typy antigenů v různých místech lidského těla (např, kůže, sliznice, krev, a tak dále. d.). To znamená, že protilátky mají dělby práce. Tyto imunoglobuliny se nazývají latinku - A, M, G, D, E a jsou označeny následovně - IgA, IgM, IgG, IgD, IgE.

V diagnostice pomocí pouze jeden typ protilátky, která je nejvíce specifický pro definovaný mikroba. To znamená, že vazba protilátek jsou definovány s antigenem se vždy děje. Nejčastěji se používá IgG a IgM.

Tento princip imunitní odpověď (unikátní specifičnost a přesnost rozpoznávání stanoveném biologického objektu), je základem vysoká přesnost protilátky immunosorbent pevnost analiza.V rozpoznávající antigeny, přesnost všech způsobu imunotestu je také lepší.

Enzymatická reakce

Jaká reakce - enzymové? Co je afinitní substrát a produkt?
Nyní považujeme enzymatické reakce v metodě enzymové imunoanalýzy.

Jaký je enzymatická reakce?

Enzymatická reakce - chemická reakce, ve kterém je jedna látka převádí enzymem do druhého. Látka, která působí na enzymu substrát. Látka, která se získá dopadem enzymu reakční produkt. Vyznačující se tím, rys enzymatické reakce je to, že určitý enzym působí pouze na konkrétním substrátu. Tato vlastnost enzymu rozpoznat „jejich“ substrát nazývá afinita.

Tak, každý enzym má pouze jeden, specifickou odpověď na to. Enzymů v biologickém světě ví, že velké množství, stejně jako enzymatické reakce. ELISA diagnostický používá pouze několik enzymatické reakce - ne více než 10. Když tato zvolena tak, enzymová reakční produkt, který je zbarven látky. Proč je enzymatická reakce výrobky musí být maloval? Protože neexistuje žádná jednoduchá chemická metoda pro výpočet koncentrace látky v zbarveného roztoku - colorimetry.

Metoda kolorimetrie - podstata a princip

colorimetry využívá měření hustoty barev roztoku a hustotou barvy vypočtené koncentraci veschestva.Pri Toto speciální zařízení - kolorimetru opatření barva je hustota roztoku. V kolorimetrie dva možné hustoty barvy v závislosti na koncentraci látky - je přímo úměrná závislost nebo nepřímo úměrné. V přímém poměru, tím vyšší je koncentrace látky, tím intenzivnější je hustota barva roztoku. Nepřímo úměrně, že čím vyšší je koncentrace látky, tím nižší je barva je hustota roztoku. Technicky to se uskutečňuje následovně: přijato několik roztoků o známé koncentraci látky měřená hustota těchto roztoků, koncentrace je vynesena na hustoty barev (kalibrační graf).

Dále, měření hustoty barvy roztoku, jehož koncentrace se zdá, a kalibrační křivka je hodnota koncentrace, která odpovídá úrovni naměřených hustoty barev rastvora.V moderních automatických kolorimetry jednou kalibrace se provádí, potom jednotka samotná konstrukce kalibrační křivky, která zůstává v paměti, a měření automaticky.

peroxidázy: Imunotest se nejčastěji používá následující enzymy alkalické fosfatázy, avidin.

Vzhledem k tomu, kombinovaných imunologických a enzymatické reakce v ELISA? Nyní budeme pokračovat, aby zvážila skutečné enzymového imunologického testu. Jaké jsou fáze, že zahrnuje a co se stane, když se tyto reakce? Linked immunosorbent assay je přímá a nepřímá.

Direct-linked immunosorbent assay - stádia

V přímém ELISA za použití protilátek k identifikaci antigen spojený s určitým štítkem. Tento konkrétní značka je substrátem pro enzymatické reakce.

Připevnění antigenu na povrchový antigen a sloučeninu jamek s protilátkou

Jak přímá enzymoimunoanalýzou? Vezměte biologického materiálu (krev, hlen stěry, stěrů) a umístěny do speciálních jamek. Biologický materiál je ponechán v jamkách po dobu 15-30 minut, aby antigeny by mohly přilepit na povrch jamek. Dále, v těchto jamek se přidá protilátka pro detekci antigenu. To znamená, že identifikační antigeny, jako je například syfilis, přidá protilátky proti syfilis antigeny. Tyto protilátky jsou produkovány průmyslovými metodami, a laboratorní koupit ready nabory.Dannuyu směs materiálu a protilátky ponechat po určitou dobu (od 30 minut do 45 hodin), aby protilátky byly schopny najít a dostat se do kontaktu s „jejich“ antigenom.Chem více biologických antigeny vzorku, tím více protilátek kontaktu s nimi.

Odstranění „zbytečných“ protilátky

Jak již bylo uvedeno, tyto protilátky jsou také spojené s konkrétním metkoy.Poskolku protilátek se přidá v přebytku, ne všechny z nich se do styku s antigeny, a v případě, že je ve vzorku není antigen, pak v důsledku toho ani protilátka není v kontaktu s požadovaným antigenem. Pro odstranění „extra“ protilátky, obsah jamek právě nalil. Výsledkem je, že všechny protilátky „přebytek“ se odstraní, a které jsou spojeny s antigeny, jako antigeny „lepený“ na povrch jamek. Jamky byly promyty několikrát se speciální řešení, které umožňuje, aby umýt všechny „extra“ protilátky.

Enzymatická reakce - tvorba barevné sloučeniny

Pak se začíná druhá fáze - enzymatické reakce. Promyté jamky byly přidány do roztoku enzymu a nechá se stát po dobu 30-60 minut. Tento enzym má afinitu k látce (specifická tag), která je spojena s protilátkou. Enzymové reakce byly prováděny, jak je v důsledku čehož tento konkrétní štítek (substrát) je přeměněn na barevné látky (výrobku). Pak metoda kolorimetrie je, že koncentrace barevné látky. Vzhledem k tomu, tento konkrétní značka je spojena s protilátkou, poté se koncentrace barevného reakčního produktu, se rovná koncentraci protilátky. Koncentrace protilátek rovná antigenu koncentraci. Tak, jako výsledek analýzy, dostaneme odpověď, jaká je koncentrace detekovaného mikroba nebo hormonu.

To je to, co projde rovnou imunoanalýzou. V současné době se však častěji používat nepřímé immunosorbent assay, protože citlivost a přesnost nepřímé vyšší než přímé. Takže, pojďme nepřímé enzymového imunologického testu.

Nepřímá enzymová imunoanalýza - stádia

V nepřímé ELISA dvou fázích. V první fázi se používají neznačené protilátky k detekovatelné antigeny, a ve druhém stupni se aplikuje na první protilátek značených protilátek neznačeného. To není dosaženo přímé vazby protilátky na antigen, a dvojitá kontrola: Vazba protilátky na antigen, načež se vazba druhého komplexu protilátka s protilátkou + antigenu. Typicky se protilátka pro první stupeň - myší a na druhé - kozy.

Fixace antigenů na povrchu jamek a vázat antigen s neznačené protilátky
Stejně jako pro přímé enzymoimunoeseje provádí plot biologickým materiálem - krevní stěry, šmouhy. Zkoumali biologický materiál se přidá do jamek a nechá se stát po dobu 15-30 minut pro lepení k povrchovým antigenům jamek. Pak byly jamky přispívají neznačených protilátek na antigeny a ponechá se dobu (1-5 hodiny) na protilátku kontaktu s „jejich“ antigeny a vytvořeného imunitního komplexu (první etapa). Pak vyjměte „přebytek“, nenavázané protilátky vylitím obsahu jamek. Máchání se speciálním řešením pro úplné odstranění všech non-vázané protilátky.

Vazba značené protilátky na antigen, neznačený protilátka +
Pak druhou protilátku - značeného, ​​přidáno do jamek a znovu se nechá stát po určitou dobu - 15-30 minut (druhá noha). Během této doby, značené protilátky se vážou na první - nejsou označeny a tvoří komplex protilátka - antigen + + protilátky. Nicméně, označené, a značená protilátka jsou zavedeny do jamek v přebytku. Z tohoto důvodu je třeba ještě jednou, aby se odstranily „extra“, již značených protilátek, které se vážou na neznačenou protilátku. Tento postup se opakuje pro vylévání obsahu jamek a promytí speciálním roztokem.

Enzymatická reakce - tvorba barevné sloučeniny
Pak o enzym, že se reakce provádí konverzí „značky“, v barevném látky. Zabarvení během 5-30 minut. Potom se provádí kolorimetrie a výpočet koncentrace barevné látky. Vzhledem k tomu, koncentrace barevné látky je označena koncentrace protilátky a koncentrace stopovací látky je rovna koncentraci neznačených protilátek, což se rovná koncentraci antigenu. Dostáváme tak koncentraci antigenu detekovatelné.
Takový dvojitý ovládání pomocí dvou druhů protilátek zvýšila citlivost a specifičnost enzymu imunoanalýzou. Přes prodloužení doby analýzy a zařazení dalších kroků, tyto ztráty jsou kompenzovány přesnost výsledku. To je důvod, proč v současné době drtivá většina enzymových imunologických technik - to je nepřímým enzymoimuno.

Jaké nemoci jsou detekovány enzymové imunoanalýzy diagnostiky?

Podívejme se nyní, jaký druh onemocnění a jakékoliv biologicky aktivní látka zjištěna enzymoimunoanalýzou. Látky detekované enzymovým imunotestem jsou uvedeny v tabulce.


Níže uvedená tabulka není kompletní seznam testů (jen nejběžnější), prováděna pomocí ELISA. Přivést celý seznam není možné, protože to bude velmi velký a neustále aktualizovány. Kromě laboratorní diagnostiky pomocí enzymové imunoanalýzy se široce používá ve vědeckém výzkumu.




Autor: AK Nasedkina